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中华人民共和国国家标准
gb 31658.20-2022
食品安全国家标准
动物性食品中酰胺醇类药物及其代谢物残留量的测定
液相色谱-串联质谱法
national food safety standard-
determination of amphenicols and metabolite residues in animal
derived food by liquid chromatography-tandem mass spectrometry method
1范围
本文件规定了动物性食品中酰胺醇类药物及其代谢物残留量检测的制样和液相色谱-串联质谱测定方法。
本文件适用于猪、鸡、牛、羊的肌肉、肝脏、肾脏、脂肪组织，以及鸡蛋、牛奶、羊奶中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺残留量的测定。
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
gb/t 6682分析实验室用水规格和试验方法
3术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
4原理
试样中残留的氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺用2%氨化乙酸乙酯溶液提取，正己烷脱脂，氨化乙酸乙酯反萃取，液相色谱-串联质谱法测定，内标法定量。
5试剂和材料
除另有规定外，所有试剂均为分析纯，水为符合gb/t 6682规定的一级水。
5.1试剂
5.1.1 甲醇（ch3oh）：色谱纯。
5. 1.2 乙腈（ch3cn）：色谱纯。
5. 1.3 氨水（nh3·h2o）。
5. 1.4 乙酸乙酯（c4h8o2）。
5.1.5无水硫酸钠（na2so4）。
5.1.6氯化钠（nacl）。
5.1.7甲酸铵（hcoonh4）。
5.1.8正己烷（c6h14）。
5.2溶液配制
5.2.1 2%氨化乙酸乙酯溶液：取氨水20 ml，用乙酸乙酯稀释至1 000 ml。
5.2. 2 4%氯化钠溶液：取氯化钠4 g，用水溶解并稀释至100 ml。
5.2.3 4%氯化钠饱和的正己烷：取4%氯化钠溶液适量，加入过量的正己烷，混合，静置分层，取上层正己烷。
5.2.4 20%甲醇溶液：取甲醇20 ml，用水稀释至100 ml。
5.2.5 10 mmol/l甲酸铵溶液：取甲酸铵0.63 g，用水溶解并稀释至1 000 ml。
5.3 标准品
氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺，含量均≥99%，氯霉素-d5、甲砜霉素-d3、氟苯尼考-d3、氟苯尼考胺-d3内标，含量均≥98% ，具体见附录a。
5.4标准溶液制备
5.4.1 标准储备液：取氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺标准品各适量（相当于各活性成分约10mg），精密称定，分别加甲醇适量使溶解并稀释定容至100ml容量瓶中，配制成浓度为100μg/ml的标准储备液。-18℃以下保存，有效期12个月。
5.4.2内标储备液：取氯霉素-d5、甲砜霉素-d3、氟苯尼考-d3、氟苯尼考胺-d3内标各适量（相当于各活性成分约1 mg），精密称定，分别加甲醇适量使溶解并稀释定容至10 ml容量瓶中，配制成浓度为100 μg/ ml的内标储备液。-18℃以下保存，有效期12个月。
5.4.3混合标准中间液：分别精密量取氯霉素标准储备液0.1ml，甲砜霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺标准储备液各0.5 ml，于10 ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配制成氯霉素浓度为1 μμg/ml，甲砜霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺浓度为5 μg/ml混合标准中间液。-18℃以下保存，有效期3个月。
5.4.4 混合内标中间液：分别精密量取氯霉素-d5内标储备液0.1 ml，甲砜霉素-d3、氟苯尼考-d3、氟苯尼考胺-d3内标储备液各0.5 ml，于10 ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配制成氯霉素-d5浓度为1 μg/ml，甲砜霉素-d3、氟苯尼考-d3、氟苯尼考胺-d3浓度为5 μg/ml混合内标中间液。- 18℃以下保存，有效期3个月。
5.4.5 混合内标工作液：取混合内标中间液，用20%甲醇溶液稀释成氯霉素-d5浓度为10 ng/ml，甲砜霉素-d3、氟苯尼考-d3、氟苯尼考胺-d3浓度为50 ng/ml混合内标工作液，现配现用。
5.5 材料
6仪器和设备
6.1液相色谱-串联质谱仪：配电喷雾离子源（esi）。
6.2 天平：感量0.0001 g和0.01 g。
6.3 均质机。
6.4涡旋混合器。
6.5多管涡旋振荡器。
6.6 高速冷冻离心机：转速可达8 000 r/min。
6.7氮吹仪。
7试样的制备与保存
7.1试样的制备
7.1.1肌肉、肝脏、肾脏和脂肪组织
取适量新鲜或解冻的空白或供试组织，绞碎，并均质。
a）取均质后的供试样品，作为供试试样；
b）取均质后的空白样品，作为空白试样；.
c）取均质后的空白样品，添加适宜浓度的标准工作液，作为空白添加试样。
7.1.2奶
取适量新鲜或解冻的空白或供试牛奶或羊奶，混合均匀。
a）取混合均匀后的供试样品，作为供试试样；
b）取混合 均匀后的空白样品，作为空白试样；
c）取均质后的空白样品，添加适宜浓度的标准工作液，作为空白添加试样。
7.1.3 鸡蛋
取适量新鲜或冷藏的空白或供试鸡蛋，去壳，并均质。
a）取均质后的供试样品，作为供试试样；
b）取均质后的空白样品，作为空白试样；
c）取均质后的空白样品，添加适宜浓度的标准工作液，作为空白添加试样。
7.2试样的保存
-18℃以下保存。
8测定步骤
8.1 提取
取试料2 g（准确至±0.05 g），置于50 ml离心管中，加混合内标工作液100μl，涡旋混匀，再加2%氨化乙酸乙酯溶液10 ml（牛奶、羊奶样品需另加无水硫酸钠3 g），涡旋30 s，涡旋振荡10 min，8 000 r/min离心5 min。上清液转入另一50 ml离心管中，残渣中加2%氨化乙酸乙酯溶液10 ml，重复提取一次。合并两次提取液，于50c氮气吹干，待净化。
8.2 净化
取待净化残渣，加4%氯化钠溶液3ml，涡旋使溶解，再加4%氯化钠饱和的正己烷5ml，涡旋30s，8 000 r/min离心5 min，弃去上层正己烷层，用4%氯化钠饱和的正己烷重复脱脂一次。加2%氨化乙酸乙酯溶液5 ml，涡旋振荡5 min，8 000 r/min离心5 min，取上层有机相。用2%氨化乙酸乙酯溶液5 ml重复萃取一次，合并有机相，50℃氮气吹干，加20%甲醇溶液1.0 ml，涡旋30s，过0.22 μm滤膜，供液相色谱串联质谱仪测定。
8.3标准曲线的制备
精密量取混合标准中间液和混合内标工作液适量，用20%甲醇溶液稀释，配制成氯霉素浓度分别为0.2 μg/l、0.5 μg/l、1 μg/l、2 μg/l、5 μg/l、10 μg/l， 甲砜霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺浓度分别为1 μg/l、2.5 μg/l、5 μg/l、10 μg/l、25 μg/l、50 μg/l，氯霉素-d5浓度均为1 μg/l，甲砜霉素-d3、氟苯尼考-d3、氟苯尼考胺-d3浓度均为5μg/l的系列标准溶液，临用现配，供液相色谱串联质谱仪测定。以定量离子峰面积比为纵坐标、浓度为横坐标绘制标准曲线，求回归方程和相关系数。
8.4 测定
8.4.1 液相色谱参考条件
a）色谱柱：c18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），或相当者；
b）柱温：30℃；
c）进样量：5μl；
d）流速：0.3 ml/min；
e）流动相：a为10 mmol/l甲酸铵溶液；b为乙腈；梯度洗脱程序见表1。
8.4.2质谱参考条件
a）离子源：电喷雾离子源；
b）扫描方式：正离子扫描/负离子扫描；
c）检测方式：多反应离子监测（mrm）；
d）脱溶剂气、锥孔气、碰撞气均为高纯氮气或其他合适气体；
e）喷雾电压、碰撞能等参数应优化至最优灵敏度；
f）待测物离子源、定性离子对、定量离子对、锥孔电压和碰撞能量参考值见表2。
8.4.3 测定法
8.4.3.1定性测定
在同样测试条件下，试料溶液中酰胺醇类药物及其代谢物的保留时间与标准工作液中酰胺醇类药物及其代谢物的保留时间相对偏差在±2.5%以内，且检测到的相对离子丰度，应当与浓度相当的校正标准溶液相对离子丰度一致。其允许偏差应符合表3要求。
8.4.3.2 定量测定
取试料溶液和相应的标准溶液，作单点或多点校准，按内标法以色谱峰面积比定量。标准溶液及试样溶液中酰胺醇类药物及其代谢物与其相应内标峰面积比均应在仪器检测的线性范围内。对于残留量超出仪器线性范围的，在提取时根据药物浓度相应增加内标工作液的添加量，使试样溶液稀释后酰胺醇类药物及其代谢物的浓度在曲线范围之内，对应内标浓度与标准工作液一致。标准溶液特征离子质量色谱图见附录b。
8.5 空白试验
取空白试料，除不加药物外，采用完全相同的测定步骤进行测定。
9 结果计算和表述
试样中酰胺醇类药物及其代谢物的残留量按标准曲线或公式（1）计算。
式中：
x——试样中酰胺醇类药物及其代谢物残留量的数值，单位为微克每千克（μg/kg）；
cis——试样溶液中酰胺醇类药物及其代谢物内标浓度的数值，单位为微克每升（μg/l）；
cs——标准溶液中酰胺醇类药物及其代谢物浓度的数值，单位为微克每升（μg/l）；
c'is——标准溶液中酰胺醇类药物及其代谢物内标浓度的数值，单位为微克每升（μg/l）；
ai——试样溶液中酰胺醇类药物及其代谢物的峰面积；
ais——试样溶液中酰胺醇类药物及其代谢物内标的峰面积；
as——标准溶液中酰胺醇类药物及其代谢物的峰面积；
a'is——标准溶液中酰胺醇类药物及其代谢物内标的峰面积；
v——溶解残渣的20%甲醇溶液体积的数值，单位为毫升（ml）；
m——试样质量的数值，单位为克（g）。
10方法灵敏度、准确度和精密度
10.1灵敏度
本方法氯霉素的检测限为0.1 μg/kg，定量限为0.2 μg/kg；甲砜霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺的检测限为0.5 μg/kg，定量限为1 μg/kg。
10.2 准确度
本方法氯霉素在0.2 μg/kg~1 μg/kg添加浓度水平，甲砜霉素在1 μg/kg~100 μg/kg添加浓度水平，氟苯尼考、氟苯尼考胺在1 μg/kg~6 000 μg/kg添加浓度水平上的回收率均为70%~ 120%。
10.3 精密度
本方法批内相对标准偏差≤15%，批间相对标准偏差≤20%。
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