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中华人民共和国国家标准
gb 31658.22-2022
代替gb/t 22286-2008、gb/t 21313-2007
食品安全国家标准 动物性食品中β-受体激动剂残留量的测定
液相色谱-串联质谱法
national food safety standard-
determination of β-agonists residues in animal derived food
by liquid chromatography-tandem mass spectrometric method
前言
本文件按照gb/t 1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
本文件代替gb/t 22286-2008《动物源性食品中多种β-受体激动剂残留量的测定 液相色 谱串联质谱法》、gb/t 21313-2007《动物源性食品中β-受体激动剂残留检测方法 液相色谱质谱/质谱法》。
本文件与gb/t 22286-2008 相比，主要变化如下：
a）修改文本格式为食品安全国家标准文本格式；
b）增加了范围中的检测组织（见第1章）；
c）增加了范围中的药物种类（见第1章）；
d）灵敏度进一步提高，待测物在猪、牛、羊的肌肉、肝脏和肾脏中的检测限为0.2μg/kg，定量限为0.5μg/kg。
本文件与gb/t 21313-2007 相比，主要变化如下：
a）修改文本格式为食品安全国家标准文本格式；
b）增加了范围中的检测组织（见第1章）；
c）增加了范围中的药物种类（见第1章）。
本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为：
——gb/t 22968-2008、gb/t 21313-2007。
1范围
本文件规定了动物性食品中β-受体激动剂残留检测的制样和液相色谱-串联质谱测定方法。
本文件适用于猪、牛、羊的肌肉、肝脏和肾脏中克仑特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、西马特罗、齐帕特罗、氯丙那林、特布他林、西布特罗、马布特罗、溴布特罗、班布特罗、克仑丙罗、妥布特罗、利托君、克仑赛罗、马喷特罗、克仑潘特和羟甲基克仑特罗共18种β-受体激动剂单个或混合物残留量的检测。
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
gb/t 6682分析实验室用水规格和试验方法
3术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
4原理
试料中残留的β-受体激动剂，酶解、高氯酸沉淀蛋白后，经乙酸乙酯、叔丁基甲醚萃取，固相萃取柱净化，液相色谱-串联质谱法测定，内标法定量。
5试剂和材料
5.1试剂
以下所用试剂，除特别注明外均为分析纯试剂，水为符合gb/t 6682规定的一级水。
5.1.1 乙腈（ch3cn）：色谱纯。
5.1.2 甲醇（ch3oh）：色谱纯。
5. 1.3 甲酸（hcooh）：色谱纯。
5. 1.4 高氯酸（hclo4）：70%~72%。
5. 1.5 氨水（nh3·h2o）。
5.1.6 乙酸乙酯（ch3cooc2h5）：色谱纯。
5.1.7 叔丁基甲醚[ch3oc（ch3）3]：色谱纯。
5.1.8 β-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶（β-glucuronidase/aryl sulfatase）：30 u/60 u/ml。
5.2 溶液配制
5.2.1 0.2 mol/l乙酸铵缓冲液：取乙酸铵15.4 g，溶解于1 000 ml水中，用乙酸调ph至5.2。
5.2.2 0.1 mol/l高氯酸溶液：取高氯酸8.7 ml，用水稀释至1 000 ml。
5.2.3 10 mol/l氢氧化钠溶液：称取40 g氢氧化钠，用适量水溶解冷却后，用水稀释至100 ml。
5.2.4 2%甲酸溶液：取甲酸2 ml，用水稀释至100 ml。
5.2.5 5%氨化甲醇溶液：取氨水5 ml，用甲醇稀释至100 ml。
5.2.6 0.1%甲酸乙腈溶液：取甲酸1 ml，用乙腈稀释至1 000 ml。
5.2.7 0.1%甲酸溶液：取甲酸1 ml，用水稀释至1 000 ml。
5.2.8 甲醇-0.1%甲酸溶液（10 90，v/v）：取甲醇10 ml和0. 1%甲酸溶液90 ml，混匀。
5.3标准品
5.3.1 β-受体激动剂：克仑特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、西马特罗、齐帕特罗、氯丙那林、特布他林、西布特罗、马布特罗、溴布特罗、班布特罗、克仑丙罗、妥布特罗、利托君、克仑赛罗、马喷特罗、克仑潘特和羟甲基克仑特罗，含量均≥98.0%，见附录a。
5.3.2同位素内标：克仑特罗-d9、盐酸莱克多巴胺-d6、沙丁胺醇-d3、西马特罗-d7、齐帕特罗-d7、氯丙那林-d7、特布他林-d9、西布特罗-d9、盐酸马布特罗-d9、盐酸班布特罗-d9、克仑丙罗-d7、盐酸妥布特罗-d9和羟甲基克仑特罗-d6，含量均≥98.0%。见附录a。
5.4标准溶液的配制
5.4.1混合标准储备液：精密称取克仑特罗等标准品约10 mg，用甲醇溶解并定容至10 ml容量瓶中，配制成浓度为1.0 mg/ml的标准储备液。-18℃以下保存，有效期12个月。
5.4.2混合内标储备液：精密称取克仑特罗-d9等同位素内标约10mg，用甲醇溶解并定容至10ml容量瓶中，配制成浓度为1.0 mg/ml的内标储备液。-18℃以下保存，有效期12个月。
5.4.3混合标准工作液：精密量取1 mg/ml的混合标准储备液100μl，于10 ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配制成浓度为10 μg/ml的标准工作液。-18℃以下保存，有效期6个月。
5.4.4混合内标工作液：精密量取1mg/ml的混合内标储备液100ul，于10ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配制成浓度为10 μg/ml的内标工作液。-18℃以下保存，有效期6个月。
5.5 材料
5.5.1混合型阳离子交换固相萃取柱：60 mg/3 ml，或相当者。
5.5.2微孔滤膜：0.22 μm。
6仪器和设备
6.1液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源（esi）。
6.2 分析天平：感量0.00001 g。
6.3 天平：感量0.01 g。
6.4恒温振荡水浴摇床。
6.5涡旋混合器。
6.6 高速离心机。
6.7 振荡器。
6.8 氮吹仪。
6.9固相萃取装置。
7试样的制备与保存
7.1试样制备
取适量新鲜或解冻的空白或供试样品，并均质。
a）取均质后的供试样品，作为供试试样；
b）取均质后的空白样品，作为空白试样；
c）取均质后的空白样品，添加适宜浓度的标准工作液，作为空白添加试样。
7.2 试样保存
-18℃以下保存。
8测定步骤
8.1酶解与提取
称取试料2 g（准确至±0.05 g），于50 ml离心管内，加0.2 mol/l乙酸铵缓冲溶液6 ml、β-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶40 μl，涡旋混匀，37℃避光水浴振荡16 h，放置至室温，备用。
8.2萃取、净化与浓缩
取备用液，加100 ng/ml内标工作液100μl，涡旋混匀，8000 r/min离心8 min，取上清液，加0.1 mol/l高氯酸溶液5 ml，涡旋混匀，用高氯酸调ph至1.0±0.2，8 000 r/min离心8 min后，将上清液用10 mol/l naoh溶液调ph至10±0.5。加乙酸乙酯15 ml，中速振荡5 min，5 000 r/min离心5 min，取上层有机相。下层水相中再加入叔丁基甲醚10 ml，中速振荡5 min，5 000 r/ min离心5 min，取上层有机相，合并，50℃下氮气吹干，用2%甲酸溶液5 ml溶解，备用。
取混合型阳离子交换固相萃取柱，依次用甲醇、2%甲酸溶液各3 ml活化，取备用液过柱，依次用2%甲酸溶液、甲醇各3 ml淋洗，抽干，用5%氨化甲醇溶液3 ml洗脱；洗脱液在50℃下氮气吹干。
残余物中加入甲醇-0.1%甲酸溶液（10 90，v/v）0.5 ml，充分溶解，过0.22μm微孔滤膜，供液相色谱-串联质谱仪测定。
8.3 标准曲线的制备
精密量取混合标准工作液混合内标工作液适量，用甲醇-0. 1%甲酸溶液（10 90，v/v）稀释成浓度为1 ng/ml、2 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml和50 ng/ml的系列标准工作液，含内标均为5ng/ml，供液相色谱-串联质谱法测定。以待测药物特征离子色谱峰的峰面积与对应内标物特征离子色谱峰的峰面积比值为纵坐标，相应的标准溶液浓度比为横坐标，绘制标准工作曲线，求回归方程和相关系数。
8.4 测定
8.4.1 液相色谱参考条件
a）色谱柱：，或相当者。
b）流动相：a相为0.1%甲酸溶液，b相为0.1%甲酸乙腈溶液。流动相梯度为0 min~0.5 min保持5%b；0.5 min~5 min，5%b线性变化到60%b，5 min~6.5 min， 保持95%b，6.5 min~8.5 min保持5%b。
c）流速：0.4 ml/min。
d）进样量：5 μl。
e）柱温：30℃。
8.4.2 串联质谱参考条件
a）离子源：电喷雾离子源；
b）扫描方式：正离子扫描；
c）检测方式：多反应离子监测（mrm）；
d）电喷雾电压：5 500 v；
e）离子源温度：550℃；
f）辅助气1：50 psi；
g）辅助气2：60 psi；
h）气帘气：30 psi；
i）碰撞气：medium.
待测药物定性离子对、定量离子对、去簇电压和碰撞能量参考值见表1。
8.4.3测定法
8.4.3.1定性测定
在同样的测试条件下，试样溶液的保留时间与标准溶液保留时间的偏差应在±2.5%之内；试样溶液中的离子相对丰度与标准溶液中的离子相对丰度相比，符合表2的要求。
8.4.3.2 定量测定
取试样溶液和标准工作液，作单点或多点校准，按内标法定量。系列标准工作液及试样溶液中目标物的响应值均应在仪器检测的线性范围内。在上述液相色谱-串联质谱条件下，标准溶液中各特征离子质量色谱图见附录b中的图b。
8.5空白试验
取空白试料，除不添加药物外，采用完全相同的测定步骤进行平行操作。
9结果计算和表述
试样中β-受体激动剂残留量按标准曲线或公式（1）计算。
式中：
x——试样中β-受体激动剂残留量的数值，单位为微克每千克（μg/kg）；
a——试样溶液中β-受体激动剂的峰面积；
as——标准溶液中β受体激动剂的峰面积；
ais——试样溶液中β-受体激动剂对应内标的峰面积；
a’ is——标准溶液中β受体激动剂对应内标的峰面积；
cs——标准溶液中β-受体激动剂浓度的数值，单位为纳克每毫升（ng/ml）；
cis——试样溶液中β受体激动剂内标浓度的数值，单位为纳克每毫升（ng/ml）；
c’ is——标准溶液中β受体激动剂内标浓度的数值，单位为纳克每毫升（ng/ml）；
v——溶解最终残余物体积的数值，单位为毫升（ml）；
m——供试试样质量的数值，单位为克（g）。
10 检测方法的灵敏度、准确度和精密度
10.1灵敏度
本方法对猪、牛、羊的肌肉、肝脏和肾脏的检测限为0.2μg/kg，定量限为0.5μg/kg。
10.2 准确度
本方法对于猪、牛 、羊的肌肉、肝脏和肾脏中β-受体激动剂在0.5μg/kg~10μg/kg添加浓度上的回收率为60%~120%。
10.3 精密度
本方法批内相对标准偏差≤20%，批间相对标准偏差≤20%。
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