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中华人民共和国国家标准
gb 31657.3-2022
代替gb/t 22942-2008
食品安全国家标准
蜂产品中头孢类药物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法
national food safety standard-
determination of cephalosporins residues in bee products by liquid
chromatography-tandem mass spectrometric method
前言
本文件按照gb/t 1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
本文件代替gb/t 22942-2008《蜂蜜中头孢唑啉、头孢匹林、头孢氨苄、头孢洛宁和头孢喹肟残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》。与gb/t 22942-2008相比，除结构调整和编辑性改动外，主要变化如下：
——标准文本格式修改为食品安全国家标准文本格式；
——标准范围中增加了蜂王浆和蜂王浆冻干粉的检测；
——标准范围增加药物品种数量；
——标准灵敏度进一步提高。
本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为：
——gb/t 22942-2008。
1范围
本文件规定了蜂蜜、蜂王浆和蜂王浆冻干粉中头孢氨苄、头孢拉定、头孢唑林、头孢哌酮、头孢乙腈、头孢匹林、头孢洛宁、头孢喹肟、头孢噻肟残留量检测的制样和液相色谱-串联质谱测定方法。
本文件适用于蜂蜜、蜂王浆和蜂王浆冻干粉中头孢氨苄、头孢拉定、头孢唑林、头孢哌酮、头孢乙腈、头孢匹林、头孢洛宁、头孢喹肟、头孢噻肟残留量的检测。
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
gb/t 6682分析实验室用水规格和试验方法
3术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
4原理
试样中残留的头孢类药物，经磷酸盐缓冲溶液提取，亲水亲脂平衡固相萃取柱净化，液相色谱串联质谱法测定，基质校准外标法定量。
5试剂与材料
除另有规定外，所有试剂均为分析纯，水为符合gb/t 6682规定的一级水。
5.1 试剂
5.1.1 甲醇（ch3oh）：色谱纯。
5. 1.2 乙腈（ch3cn）：色谱纯。
5.1.3 甲酸（hcooh）：色谱纯。
5.1.4 磷酸二氢钾（kh2po4）。
5.1.5 氢氧化钠（naoh）。
5.2溶液配制
5.2.1 2.5 mol/l氢氧化钠溶液：取氢氧化钠50 g，加水溶解并稀释至500 ml。
5.2.2 30%乙腈溶液：取乙腈30ml，用水稀释至100ml。
5.2.3 0.05 mol/l磷酸盐缓冲溶液（ph=8.5）：取磷酸二氢钾6.8 g，用水溶解并稀释至1 0000 ml，用2.5 mol/l氢氧化钠溶液调节ph至8.5。
5.2.4 0. 1%甲酸溶液：取甲酸1 ml，用水溶解并稀释至1 000 ml。
5.2.5 0.1%甲酸溶液-甲醇：取0.1%甲酸溶液95ml，加甲醇5ml，混匀。
5.3 标准品
头孢氨苄、头孢拉定、头孢唑林、头孢哌酮、头孢乙睛、头孢匹林、去乙酰基头孢匹林、头孢洛宁、头孢喹肟、头孢噻肟、含量均≥95.0%。具体信息见附录a。
5.4标准溶液制备
5.4.1 标准储备液：取标准品各10 mg，精密称定，加30%乙腈溶液适量使溶解并定容至25 ml容量瓶，配制成浓度为400 μg/ml的溶液。-18℃以下避光保存，有效期1个月。
5.4.2混合标准储备液：分别准确移取各标准储备液0.25ml于10ml容量瓶，用30%乙腈溶液稀释至刻度，配制成浓度为10 μg/ml的混合标准储备液。-18℃以下避光保存，有效期7 d。
5.4.3 混合标准工作液：准确移取混合标准储备液适量，用0.1%甲酸溶液-甲醇稀释成浓度为2.5 μg/l、5. 0 μg/l、20 μg/l、100 μg/l、200 μg/l和500 μg/l的系列混合标准工作溶液。现配现用。
5.5材料
5.5.1 固相萃取小柱：亲水亲脂平衡型固相萃取柱，500 mg/6 ml，或相当者。
5.5.2 滤膜：尼龙材质，孔径0.22 μm或性能相当者。
6仪器和设备
6. 1液相色谱-串联质谱仪：配电喷雾离子源。
6.2 分析天平：感量0.0001 g和0.01 g。
6.3氮吹仪。
6.4固相萃取装置。
6.5涡旋混合器。
6.6 离心机：最大转速6 000 r/min或以上。
6.7离心管：聚丙烯塑料离心管，10 ml、50 ml。
6.8 ph计。
7试样的制备与保存
7.1试样的制备
取适量新鲜或冷藏的空白或供试蜂产品，如无结晶，将其搅拌混合均匀，有结晶，则置于不超过60℃的水浴中温热，振荡，待样品全部融化后搅匀，并冷却至室温。蜂王浆和蜂王浆冻干粉从冷冻环境中取出，搅拌均匀后取样。
a）取均匀后的供试样品，作为供试试样；
b）取均匀后的空白样品，作为空白试样；
c）取均匀后的空白样品，添加适宜浓度的标准工作液，作为空白添加试样。
7.2 试样的保存
-18℃以下保存。
8测定步骤
8.1 提取
8.1.1 蜂蜜
取试料5g（准确至±0.05g），于50ml离心管中，加0.05mol/l磷酸盐缓冲溶液25ml，溶解样品，涡旋混匀后用2.5mol/l氢氧化钠溶液调节ph至8.5，备用。
8.1.2 蜂王浆和蜂王浆冻干粉
取蜂王浆2.5 g（准确至±0.05 g）或蜂王浆冻干粉1.0 g（准确至±0.05 g），于50 ml离心管中，加0.05 mol/l磷酸盐缓冲溶液25 ml，涡旋混匀后用2.5 mol/l 氢氧化钠溶液调节ph至8.5，以6 000 r/min离心5 min，取上清液，备用。
8.2净化
取固相萃取柱，依次用甲醇5 ml、0.05 mol/l磷酸盐缓冲溶液10 ml活化，取备用液，过柱，待液面到达柱床表面时再依次用磷酸盐缓冲溶液3ml和水2ml淋洗，弃去全部流出液。用乙腈3ml洗脱，收集洗脱液于10ml离心管中，洗脱液在40℃水浴中氮气吹干，加0.1%甲酸溶液-甲醇1.0 ml溶解，过0.22μm滤膜，供液相色谱-串联质谱测定。
8.3基质匹配标准曲线的制备
取空白试料样依次按8.1和8.2处理，40℃水浴氮气吹干，分别加系列混合标准工作溶液1.0 ml溶解残渣，过0.22 μm滤膜，制备2.5 μg/l、5.0 μg/l、20 μg/l、100 μg/l、200 μg/l和500 μg/l的系列基质匹配标准工作溶液，供液相色谱串联质谱测定。以定量离子对峰面积为纵坐标、标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。求回归方程和相关系数。
8.4 测定
8.4.1 液相色谱参考条件
a）色谱柱：c18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）或相当者；
b）流动相：a为0.1%甲酸溶液，b为甲醇，梯度洗脱程序见表1；
c）流速：0.3 ml/min；
d）柱温：35℃；
e）进样量：10 μl。
8.4.2质谱参考条件
a）离子源：电喷雾（esi）离子源；
b）扫描方式：正离子扫描；
c）检测方式：多反应监测（mrm）；
d）毛细管电压：2 000 v；
e）rf透镜电压：0.5 v；
f）离子源温度：150℃；
g）脱溶剂气温度：500℃；
h）锥孔气流速：50 l/h；
i）脱溶剂气流速：1 000 l/h；
j）二级碰撞气：氩气；
k）定性离子对、定量离子对、碰撞能量和锥孔电压见表2。
8.4.3 测定法
取试料溶液和基质匹配标准溶液，作单点或多点校准，按外标法以色谱峰面积定量。基质匹配标准溶液及试料溶液中目标药物的特征离子质量色谱峰峰面积均应在仪器检测的线性范围之内。试料液中待测物质的保留时间与基质匹配标准工作液中待测物质的保留时间之比，偏差在±2.5%以内，且试料溶液中的离子相对丰度与基质匹配标准溶液中的离子相对丰度相比，符合表3的要求，则可判定为样品中存在对应的待测物质。标准溶液多反应监测色谱图见附录b。
8.5 空白试验
取空白试料，除不加药物外，采用完全相同的测定步骤进行平行操作。
9结果计算和表述
试样中待测药物的残留量按标准曲线或公式（1）计算。
式中：
x——试样中待测药物残留量的数值，单位为微克每千克（μg/kg）；
cs——标准溶液中待测药物浓度的数值，单位为微克每升（μg/l）；
a——试样溶液中待测药物的峰面积；
as——标准溶液中待测药物的峰面积；
v——定容体积的数值，单位为毫升（ml）；
m——试样质量的数值，单位为克（g）。
注：头孢匹林残留量以头孢匹林和去乙酰基头孢匹林之和计。
10 检测方法的灵敏度、准确度和精密度
10. 1灵敏度
本方法中头孢哌酮、头孢乙腈和头孢唑林3种药物在蜂蜜、蜂王浆和蜂王浆冻干粉中的检测限分别为2.0 μg/kg、4.0 μg/kg和10 μg/kg，定量限分别为4.0 μg/kg、8.0 μg/kg和20μg/kg；其余头孢类药物和去乙酰基头孢匹林在蜂蜜、蜂王浆和蜂王浆冻干粉中的检测限分别为0.5 μg/kg、1.0 μg/kg和2.5 μg/kg，定量限分别为1.0 μg/kg、2.0 μg/kg和5.0 μg/kg。
10.2准确度
本方法在1.0 μg/kg~40 μg/kg添加浓度水平上的回收率为60% ~ 120%。
10.3 精密度
本方法的批内相对标准偏差≤15%，批间相对标准偏差≤20%。
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