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中华人民共和国国家标准

gb 5009.288-2023

食品安全国家标准 食品中胭脂虫红的测定

1范围

  本标准规定了食品中胭脂虫红的液相色谱测定方法。

  本标准适用于食品中胭脂虫红的测定。

2原理

  试样中的胭脂虫红，经盐酸溶液提取，固相萃取柱净化后，反相c18液相色谱柱分离，紫外可见光检测器检测，外标法定量。

3试剂和材料

  除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为gb/t 6682规定的一级水。

3.1 试剂

3.1.1甲醇(ch3oh)：色谱纯。

3.1.2乙腈(ch3cn)：色谱纯。

3.1.3盐酸(hcl)。

3.1.4磷酸(h3po4)。

3.2试剂配制

3.2.1盐酸溶液(2.0 mol/l)：量取168 ml盐酸至盛有800 ml水的1 000 ml容量瓶中，充分混匀后，冷却至室温，用水定容至刻度。

3.2.2磷酸甲醇溶液(2%)：量取20 ml磷酸至盛有800 ml甲醇的1 000 ml容量瓶中，充分混匀后，冷却至室温，用甲醇定容至刻度。

3.2.3磷酸水溶液(0.1%)：吸取1.0 ml磷酸至盛有800 ml水的1000 ml容量瓶中，充分混匀后，冷却至室温，用水定容至刻度。

3.2.4磷酸乙腈溶液(0.1%)：吸取1.0 ml磷酸至盛有800 ml乙腈的1 0000 ml容量瓶中，充分混匀后，冷却至室温，用乙腈定容至刻度。

3..3 标准品

  胭脂红酸标准品(c22h20o13，cas号：1260-17-9)：纯度≥95.5%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准品。

3.4标准溶液配制

3.4.1胭脂红酸标准储备液(1.00 mg/ ml) ：准确称取100.0 mg(精确至0.1 mg)标准品，用水溶解，并定容至100 ml容量瓶中，摇匀，于4℃下避光保存，有效期3个月。

3.4.2胭脂红酸标准系列工作液：用移液管(精确至0.01 ml)准确吸取标准储备液(1.00 mg/ ml)

0.5 ml于100 ml容量瓶中；分别准确吸取标准储备液(1.00 mg/ml)0.1 ml、0.2 ml、0.5 ml和1.0 ml于10.0 ml容量瓶中，用磷酸水溶液(0.1%)定容至刻度，摇匀，配制成质量浓度分别为5.00 mg/l、10.0 mg/l、20.0 mg/l、50.0 mg/l和100 mg/l胭脂红酸标准系列工作液。临用现配。

3.5材料

  固相萃取柱(150mg/6ml，混合型强阴离子交换反相柱，填料为含亲水基团的聚苯乙烯/二乙烯基苯共聚物上键合季铵基团，或相当者)。

4仪器和设备

4.1 高效液相色谱仪：带紫外可见光检测器。

4.2天平：感量分别为0.1 mg和1 mg。

4.3恒温水浴锅。

4.4涡旋混合器。

4.5超声波发生器。

4.6高速离心机。

4.7固相萃取装置。

4.8氮吹仪。

4.9粉碎机。

5分析步骤

5.1试样制备

  液态样品摇匀待提取；基质均匀的半固态样品和粉状样品直接待提取；其他样品需匀浆或粉碎均匀待提取。制备好的试样于0℃~5℃保存，尽快测定。

5.2试样提取

5.2.1液体、半固体试样(含乳半固体除外)

  称取2 g(精确至0.001 g)试样于50 ml离心管中，加入盐酸溶液(2.0 mol/l)40 ml，旋紧盖子，摇匀，置于沸水浴中加热30 min，取出冷却至室温后，振荡5 min，超声5min，5000 r/min离心5 min，上清液转移至50.0ml容量瓶中，用水定容至刻度，经适量脱脂棉过滤，待净化。

5.2.2固体、含乳半固体试样(调制乳粉除外)

  称取2 g(精确至0.001 g)试样于50 ml离心管中，加入盐酸溶液(2.0 mol/l)40 ml，旋紧盖子，摇匀，置于沸水浴中加热30 min，取出冷却至室温后，振荡5 min，超声5min，5 000 r/min 离心5 min，上清液转移至100 ml容量瓶中，残渣加入盐酸溶液(2.0 mol/l)40 ml，常温条件下，重复提取1次，合并2次提取液，用水定容至刻度，经适量脱脂棉过滤，待净化。

5.2.3调制乳粉

  称取2 g(精确至0.001 g)试样于50 ml离心管中，加入盐酸溶液(2.0 mol/l)40 ml，旋紧盖子，摇匀，置于沸水浴中加热30min，取出冷却至室温后，振荡5min，超声5min，5000r/min离心5min，上清液转移至250 ml容量瓶中，残渣加入盐酸溶液(2.0 mol/l)40 ml，常温条件下，重复提取2次，合并3次提取液，用水定容至刻度，经适量脱脂棉过滤，待净化。

5.3试样净化

  固相萃取柱使用前依次用6ml甲醇、6ml水进行活化，保持柱体湿润，取过滤液25.0ml通过活化后的固相萃取柱(150 mg/6 ml)，依次用12 ml水和6 ml甲醇淋洗，弃去淋洗液，真空抽至柱体近干，用磷酸甲醇溶液(2%)6 ml进行洗脱，收集洗脱液，于40℃水浴下氮吹浓缩至近干，加入2.00 ml磷酸水溶液(0.1%)复溶，涡旋混匀，12000 r/min离心5 min，取上清液待进样。

5.4 空白试验

  除不加试样外，按5.2和5.3与试样同时处理。

5.5仪器参考条件

5.5.1色谱柱：c18(4.6 mm×150 mm，5.0 μm)或性能相当者；

5.5.2流动相：a 为磷酸水溶液(0.1%)，b为磷酸乙腈溶液(0.1%)，洗脱梯度程序见表1；

5.5.3柱温：40 ℃；

5.5.4流速：1.2 ml/min；

5.5.5检测波长：494 nm；

5.5.6进样量：10μl。

5.6标准曲线的制作

  将标准系列工作液分别注入液相色谱仪中，测定相应的峰面积，以标准工作液的浓度为横坐标，以峰面积响应值为纵坐标，绘制标准曲线。胭脂红酸标准溶液的色谱图参见附录a中图a.1。

5.7试样溶液的测定

  将试样溶液注入液相色谱仪中，根据保留时间定性，变化范围应在±2.5%之内，峰面积定量，根据标准曲线得到待测液中胭脂红酸的浓度。

6分析结果的表述

试样中胭脂虫红(以胭脂红酸计)含量按公式(1)计算。

式中：

x——试样中胭脂虫红(以胭脂红酸计)的含量，单位为克每千克(g/kg)；

c——待测试样中胭脂虫红(以胭脂红酸计)的浓度，单位为毫克每升(mg/l)；

v——试样提取液的定容体积，单位为毫升(ml)；

2.00——分取提取液净化后的定容体积，单位为毫升(ml)；

1 000——换算系数；

m——试样的取样量，单位为克(g)；

25.0——分取提取液的体积，单位为毫升(ml)；

计算结果保留3位有效数字。

7精密度

  在重复性条件下获得的2次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15 %。

8其他

  本方法的检出限为：当称样量为2g时，液体及半固体试样(含乳半固体除外)中胭脂虫红(以胭脂红酸计)检出限为0.006g/kg，固体及含乳半固体试样(调制乳粉除外)中胭脂虫红(以胭脂红酸计)检出限为0.01 g/kg，调制乳粉中胭脂虫红(以胭脂红酸计)检出限为0.03 g/kg。

  本方法的定量限为：当称样量为2 g时，液体及半固体试样(含乳半固体除外)中胭脂虫红(以胭脂红酸计)定量限为0.02g/kg，固体及含乳半固体试样(调制乳粉除外)中胭脂虫红(以胭脂红酸计)定量限为0.04 g/kg，调制乳粉中胭脂虫红(以胭脂红酸计)定量限为0.1 g/kg。