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中华人民共和国国家标准
gb/t 42113-2022
农产品中生氰糖苷的测定 液相色谱-串联质谱法
determination of cyanogenic glycosides in agricultural products-
liquid chromatography with tandem-mass spectrometry method
1范围
本文件描述了农产品中亚麻苦苷、β-龙胆二糖丙酮氰醇、百脉根苷、β-龙胆二糖甲乙酮氰醇、紫杉氰苷、蜀黍苷、苦杏仁苷、黑野樱苷的液相色谱-串联质谱测定方法。
本文件适用于木薯、亚麻籽、高粱、竹笋、杏仁等农产品中生氰糖苷含量的测定。
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
gb/t 6682分析实验室用水规格和试验方法
3术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
4原理
试样中生氰糖苷，经80%甲醇水溶液提取，固相萃取柱净化，液相色谱-串联质谱测定，外标法定量。
5试剂和材料
除非另有说明，在分析中仅使用分析纯试剂，以及符合gb/t 6682规定的一级水。
5.1试剂
5.1.1甲醇(ch3oh，cas号：67-56-1)：色谱纯。
5.1.2 乙腈(ch3cn，cas号：75-05-8) ：色谱纯。
5.1.3 甲酸(hcooh，cas号：64-18-6)：色谱纯。
5.2试剂配制
5.2.1 0.1%甲酸水溶液(体积分数)：准确吸取1.00 ml甲酸(5.1.3)，用水定容至1 l。
5.2.2 80%甲醇水溶液(体积分数)：量取80 mi，甲醇(5.1.1)，加20 ml水.混匀。
5.2.3 10%甲醇水溶液(体积分数)：量取10 ml甲醇(5.1.1)，加90 ml水，混匀。
5.2.4 30%甲醇乙腈溶液(体积分数)：量取30 ml，甲醇(5.1.1)，加70 ml乙腈(5.1.2)，混匀。
5.3标准品
8种生氰糖苷标准品：纯度≥95%，其基本信息见附录a。
5.4标准溶液配制
5.4.1标准储备溶液(100 mg/l)：分别准确称取生氰糖苷标准品约5 mg(精确至0.01 mg)，用甲醇(5.1.1) 溶解，转移至50 ml容量瓶中，用甲醇(5.1.1)定容，配成质量浓度为100 mg/l标准储备溶液，于-18℃保存，保存期2个月。
5.4.2标准工作溶液(1 mg/l)：分别移取100 μl的8种生氰糖苷标准储备溶液(5.4.1)于10 ml棕色容量瓶中，用甲醇(5.1.1)定容，得1 mg/l标准工作溶液。现配现用。
5.5材料
5.5.1固相萃取柱：n-乙烯吡咯烷酮和二乙烯基苯共聚物填料柱(200 mg/6 ml)，或其他等效柱。使用前用2ml甲醇和2ml水依次活化。
5.5.2微孔滤膜：0.22 μm有机系。
6仪器和设备
6.1液相色谱-串联质谱仪：配电喷雾离子源。
6.2 分析天平：感量0.1 mg和0.01 mg。
6.3 分析研磨机。
6.4涡旋振荡器。
6.5离心机：转速≥4 200 r/min，带有15 ml转子。
6.6固相萃取装置。
6.7超声波清洗器(总功率 900 w)。
6.8氮吹仪。
7试样制备与保存
取500 g左右样品，用水洗净表面附着的杂物，吸水纸擦干水分，切碎，装入样品袋中，充分混匀，装入研磨杯，加入液氮冷冻，用研磨机粉碎至颗粒均匀，放入分装容器中，密封，按照第8章规定的顺序完成，或放于-18℃冻存1个月。
8测定步骤
8.1 提取
称取1 g试样(精确到0.1 mg)于15 ml离心管中，加入3 ml 80%甲醇水溶液(5.2.2)，涡旋振荡15 s，超声提取15 min，立即于4 200 r/min离心10 min，取全部上清液；向残渣中再次加入3 ml 80%甲醇水溶液<5.2.2)，按上述条件提取、商心，合并两次提取液于10 ml.容量瓶中，加水至刻度线，混匀，待净化。
8.2净化
将活化好的固相萃取柱(5.5.1)连接到固相萃取装置(6.6)。将8.1中制备的粗提液转移至萃取柱中，待样液全部流过柱子后，弃去流出液。用2 ml水淋洗柱子并彻底抽干，弃去淋洗液。用3 ml 30%甲醇乙腈溶液(5.2.4)洗脱柱子，分次洗脱，每次1 ml，流速1 ml/min，收集全部洗脱液。洗脱液氮气吹干(40℃)后，用1 ml 10%甲醇水溶液(5.2.3)复溶。过0.22μm滤膜(5，5.2)，供液相色谱-串联质谱测定。
8.3测定
8.3.1色谱参考条件
液相色谱参考条件如下：
a) 色谱柱：c18(50 mm×2.1 mm，1.8μm)色谱柱，或同等性能的色谱柱；
b) 流动相及洗脱条件见表1；
c) 流速：0.2 ml/ min；
d) 柱温：30℃；
e) 进样量：10μl。
8.3.2质谱参考条件
质谱参考条件如下：
a)离子源：电喷雾离子源；
b)扫描方式：正离子扫描模式；
c) 干燥气温度：325℃；
d) 干燥气流量：5 l/min；
e) 鞘气温度：350℃；
f) 鞘气流速：11 l/min；
g) 雾化气压力：45 mpa；
h) 毛细管电压：3 500 v；
i) 检测方式：多反应监测模式；
j) 监测离子对、碰撞能量见表2。
8.3.3标准曲线制作
取适量标准工作溶液(5.4.2) ，用10%甲醇水溶液(5.2.3)稀释成5 μg/l、10 μg/l、25 μg/l、50 μg/l、100 μg/l.200 μg/l的亚麻苦苷、β-龙胆二糖丙酮氰醇、百脉根苷、β-龙胆二糖甲乙酮氰醇、紫杉氰苷、蜀黍苷、苦杏仁苷标准溶液，以及25 μg/l、50 μg/l、100 μg/l、150 μg/l、200 μg/1的黑野樱苷标准溶液，用液相色谱-串联质谱联用仪测定，以待测物的特征离子质量色谱峰面积为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。
8.3.4定性测定
用液相色谱-串联质谱仪测定样品和标准溶液。在相同实验条件下，待测物在样品中的保留时间与在标准工作溶液中的保留时间偏差在±2.5%以内.并且色谱图中各组分定性离子对的相对丰度，与浓度接近的标准工作液中相应定性离子对的相对丰度相比，偏差不超过表3规定的范围，则可判断为样品中存在对应的待测物。
8.3.5 定量测定
用液相色谱-串联质谱仪测定样品和标准溶液，以色谱峰面积按外标法定量，根据标准曲线得到化合物浓度，平行测定不少于两次。当样品中化合物浓度超过标准溶液浓度范围时，用10%甲醇水溶液(5.2.3)适当稀释。在上述色谱和质谱条件下，8种生氰糖苷的特征离子质量色谱图见附录b。
9结果计算与表述
试样中生氰糖苷化合物含量ωi按式(1)计算：
式中：
ρ——由标准曲线求得试样溶液中生氰糖苷化合物的质量浓度，单位为微克每升(μg/l)；
v——样品溶液定容体积，单位为毫升(ml)；
m——试样质量，单位为克(g)；
f——稀释倍数。
计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果算术平均值表示，结果保留三位有效数字。
10精密度
在重复性条件下获得的两次独立的测试结果的绝对差值不大于算术平均值的20%。
11检出限与定量限
生氰糖昔化合物的检出限和定量限见表4。
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